熒光探針的基本概念

熒光探針的基本概念
在描述熒光探針時常用到下述的一些基本概念，在選擇使用熒光探針時應(yīng)予考慮。
（一）熒光的激發(fā)波長和發(fā)射波長
　　熒光探針大多是含有共扼雙鍵體系的有機化合物，容易吸收近紫外區(qū)或可見光區(qū)的激發(fā)光，而發(fā)射出可見光區(qū)的光。熒光探針只能吸收或發(fā)射一定波長范圍內(nèi)的光。探針的發(fā)射波長總是大于其激發(fā)波長，該波長差值稱為Stokes位移。
　　激發(fā)光譜指某種熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)下所測得的同一波長熒光強度的關(guān)系，即不同激發(fā)波長的相對效率。而發(fā)射光譜指該物質(zhì)在某一固定波長激發(fā)下所測得的不同波長熒光強度的關(guān)系，即不同發(fā)射波長的相對效率。激發(fā)光譜的長波部分和發(fā)射光譜的短波部分常重疊，這是分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換的結(jié)果。如圖所示，相應(yīng)于不同波長（EX1、EX2和EX3）的激發(fā)并不改變熒光的發(fā)射光譜，但其發(fā)射光（EM1、EM2和EM3）強度與激發(fā)光強度有關(guān)。



（二）熒光強度
　　熒光強度是表示熒光相對強弱的參數(shù)，它決定了檢測的靈敏度。其表達式為：



　　式中，F(xiàn)為熒光強度；K為儀器常數(shù)；Q為熒光量子產(chǎn)率；I0為激發(fā)光的強度；ε為摩爾吸收系數(shù)；b為樣品池的光徑（樣品厚度）；c為樣品濃度。
　　摩爾吸收系數(shù)ε指染料吸收激發(fā)光的能力，而量子產(chǎn)率Q在數(shù)值上等于發(fā)射量子數(shù)與吸收量子數(shù)的比值，它與發(fā)射強度直接相關(guān)。各種熒光探針在（0.1, l）區(qū)間內(nèi)有一個特征的量子產(chǎn)率，而只有當(dāng)Q >0.4時才有實用意義。
（三）熒光壽命
　　熒光壽命又稱激發(fā)態(tài)壽命，指熒光探針分子在激發(fā)態(tài)的平均停留時間（τ）。大多數(shù)熒光探針的熒光壽命在納秒級。例如，F(xiàn)ITC的τ值為4ns。熒光壽命短則可提高靈敏度。
（四）熒光探針的環(huán)境因素
　　適宜的溶劑極性、合適的pH值、猝滅劑濃度及其與探針分子的親和性以及環(huán)境溫度等環(huán)境因素都會影響到熒光探針的產(chǎn)率。因此，應(yīng)根據(jù)實驗要求選擇合適的探針和使用條件。
在選擇使用合適的熒光探針時應(yīng)注意的兩個問題如下述。
　　1 ．最大吸收波長或最大發(fā)射波長
　　應(yīng)結(jié)合現(xiàn)有儀器的激光光源可以提供的工作波長，選擇可供使用的熒光探針，并選用相應(yīng)的濾光片。
　　2 ．光漂白
　　光漂白（photobleaching）也稱光褪化效應(yīng)（fading-out effect），使用時應(yīng)盡量避免過度強光或長時間照射，以免縮短樣品使用壽命。
　　下表為常用于生物醫(yī)學(xué)顯微技術(shù)中的熒光探針，僅供參考。應(yīng)該指出的是，新的熒光探針不斷地被合成生產(chǎn)出來，在種類和性能上不斷更新，可供選擇的可能性在不斷擴大。具體可以參考有關(guān)廠家的說明材料或?qū)Ｖ�如“handbook of fluorescent probes and research chemicals”（由美國Richard P . Haugland 著，Molecular Probes公司出版）。