熒光分光光度計(jì)法的一些研究

 

　　再制干酪是采用一部分天然干酪(50％左右)，加上一些提供蛋白質(zhì)、脂肪的原料(脫脂乳粉、乳蛋白、奶油等)，再加上香料、色素、穩(wěn)定劑、水，有時(shí)還添加防腐劑.然后在乳化鹽、加熱攪拌、脫氣、冷卻的作用下形成的一種干酪食品.經(jīng)常用作切片或涂抹食用。

　　再制干酪是一種極受歡迎的食品，食用時(shí)要經(jīng)歷融化過程。融化性在一定程度上反映干酪加熱后的流動(dòng)和擴(kuò)散情況。天然干酪的類型、乳化鹽的種類及用量，冷卻溫度、冷卻時(shí)間、剪切速率等都有會(huì)影響再制干酪的融化性。融化性是衡量再制干酪質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。為了生產(chǎn)出滿意的產(chǎn)品，生產(chǎn)者需要測(cè)定再制干酪的融化性。經(jīng)驗(yàn)式測(cè)融化性的方法有：Arnott融化測(cè)試法、Schreiber融化測(cè)試法、融化管測(cè)試法。這幾種方法中較為常用的是融化管測(cè)試法， 融化管測(cè)試法要控制干酪加熱條件，受熱后干酪產(chǎn)生流動(dòng)性，測(cè)量干酪流動(dòng)的距離， 即為干酪的融化性。經(jīng)驗(yàn)式測(cè)融化性的方法有很高的可變性，它只反映干酪融化性的一種趨勢(shì)。以流變學(xué)為基礎(chǔ)測(cè)融化性的方法包括動(dòng)態(tài)剪切流變儀法、改良式擠壓流變儀法等。但這幾種方法有破壞性，且費(fèi)時(shí)、操作困難。因此迫切需要一種無破壞性、快速測(cè)定再制干酪融化性的方法。

　　熒光分光光度計(jì)法可在分子水平上反映再制干酪的融化特性.它是一種非破壞性的、快速測(cè)定再制干酪融化性的方法。由于再制干酪吸光率在0.1以上，產(chǎn)生反射作用(內(nèi)部率片作用)減少了熒光強(qiáng)度，導(dǎo)致激發(fā)光譜的扭曲。為了避免這個(gè)問題。Parker發(fā)明了一種支架， 它將光的入射角由90°變?yōu)?6°。從而減少光的散射。用這種支架的熒光分光光度計(jì)被稱為前鏡熒光分光光度計(jì)(見圖1、圖2)。它可以在分子水平上反映膠體的不同流變特性.并已經(jīng)被成功的用于乳制品和軟質(zhì)干酪的測(cè)定中。它也可用來測(cè)定天然干酪的質(zhì)地。S K Garimella研究發(fā)現(xiàn)它也可用于測(cè)再制干酪的融化性。

　　前鏡熒光分光光度計(jì)在反映蛋白質(zhì)分子相互作用上也有一定的優(yōu)越性。前鏡熒光分光光度計(jì)能提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用的信息。第一，它比其它分光光度計(jì)靈敏100-1000倍。第二，熒光物質(zhì)對(duì)環(huán)境極為敏感，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，會(huì)導(dǎo)致色氨酸的含量和發(fā)射波長(zhǎng)的改變。另外，熒光物質(zhì)的熒光團(tuán)對(duì)溶液粘性的改變極敏感。第三，熒光檢測(cè)方法是非�？焖俚摹�

　　本實(shí)驗(yàn)的目的是用一種新的方法測(cè)定涂抹型再制干酪的融化性。實(shí)驗(yàn)選取6種市售涂抹型再制干酪為原料，分別用融化管法、熒光分光光度計(jì)法測(cè)定其融化性。通過比較， 本研究探討了用前鏡熒光分光光度計(jì)測(cè)定融化性的可行性。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　所用干酪均從超市購(gòu)得.于冰柜4℃放置。6種用于實(shí)驗(yàn)的干酪分別為：奶油口味涂抹再制干酪(荷蘭)、蘑菇口味涂抹再制干酪(荷蘭)、優(yōu)質(zhì)涂抹再制干酪(德國(guó))、草莓口味涂抹再制干酪(法國(guó))、巧克力口味涂抹再制干酪(法國(guó))、洋蔥口味涂抹再制干酪(法國(guó))。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 化學(xué)試劑

　　98％硫酸，40％ 氫氧化鈉溶液。2％硼酸溶液，25％ 氨水(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))；乙醚，石油醚，乙醇，混合指示劑(甲基紅+溴甲酚綠)等�；瘜W(xué)試劑均為分析純。

1.2.2 主要儀器

　　日立F4500熒光分光光度計(jì)(日本)，自制支架，自制管式融化計(jì)，320酸度計(jì)(梅特勒公司)，JD500-2型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司)，凱式定氮儀(FOSS公司)，202型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 成分測(cè)定

(1)水分測(cè)定

　　采用直接干燥法。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試2次。取平均值為測(cè)試結(jié)果。

(2)蛋白質(zhì)測(cè)定

　　測(cè)定方法參見GB 5009.5-85。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試2次。取平均值為測(cè)試結(jié)果。

(3)脂肪測(cè)定

　　測(cè)定方法參見GB 5009.5-86。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試2次，取平均值為測(cè)試結(jié)果。

(4)pH測(cè)定

　　取12 g干酪樣品加入40mL、30℃蒸餾水， 研缽至完全溶解， 常溫下采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.2 融化管法測(cè)定融化性

(1)測(cè)試方法

　　取20g樣品裝入垂直放置的38mm×200mm的玻璃管中，樣品堆積在管底形成一定的高度，玻璃管的一端用膠塞封住，另一端用中間打孔的膠塞封上，孔中水平插入玻璃細(xì)管，將融化管水平放入110℃ 的烘箱中，放置10min，測(cè)量干酪流淌的長(zhǎng)度，作為融化性指標(biāo)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試4次。

1.3.3 熒光分光光度計(jì)法測(cè)定融化性

(1)原理

　　干酪中所有的蛋白質(zhì)(包括酪蛋白)至少殘留1種色氨酸，且色氨酸是一種天然的熒光物質(zhì)，因此可以用色氨酸的發(fā)射光譜(305~400nm，激發(fā)光譜290nm)來研究干酪的蛋白質(zhì)與其它成分的相互作用。I_MAX變化表示色氨酸含量的變化。色氨酸的這種熒光特性在疏水環(huán)境中和在親水環(huán)境中有著顯著的差異。I_MAX變化可反映色氨酸所處微環(huán)境的變化。熒光強(qiáng)度受水分、蛋白質(zhì)、脂肪的影響。因此。運(yùn)用色氨酸的熒光特性可以很好地監(jiān)控再制干酪組分在分子水平上的相互作用。

(2)測(cè)試方法

　　① 取樣測(cè)試時(shí)樣品溫度為(20+1)℃ ，用樣品將內(nèi)徑為10mm的石英比色杯裝滿。

　　② 測(cè)試條件發(fā)射光譜305~400nm，激發(fā)光譜290nm，發(fā)射狹縫寬10 nm。激發(fā)狹縫寬10 nm，重復(fù)測(cè)試4次。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

　　利用SAS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和SNK多重比較，研究成分對(duì)融化性的影響； 同時(shí)對(duì)熒光強(qiáng)度、融化性進(jìn)行相關(guān)分析。

2.1 涂抹型再制干酪成分測(cè)定

　　涂抹型再制干酪的水分含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、pH 結(jié)果見表1。

　　由表1可以看出，樣品問的水分、蛋白質(zhì)、脂肪、pH 變化范圍很大，其變化范圍分別為46.72％~63.63％ 。8.31％~11.23％，16.05％~28.25％，5.31~5.65，且差異顯著(P<0.01)。水分含量高的產(chǎn)品pH值較低(F品牌)。

2.2 融化管法測(cè)融化性

　　按1.3.2融化管法測(cè)定涂抹型再制干酪的融化性的結(jié)果見表2。

　　根據(jù)表2得出， 樣品問的融化性差異極顯著(P<0.01)。

2.3 熒光分光光度計(jì)法測(cè)融化性

　　按1.3.3熒光分光光度計(jì)測(cè)涂抹型再制干酪的融化性，結(jié)果見表3、圖3。

2.4 融化管測(cè)定融化性與熒光分光光度計(jì)法測(cè)定融化性的相關(guān)性分析

　　由表2和表3 得出色氨酸 λ_MAX（出峰處的波長(zhǎng)值）在335～350nm范圍時(shí)，I_MAX與干酪的融化性成強(qiáng)相關(guān)性（R²=0.9425）（見圖4）。I_MAX（最大熒光強(qiáng)度）與再制干酪的融化性成負(fù)相關(guān)。這與S K Garimella研究的結(jié)果相一致。

溫度計(jì)| 溫度表| 風(fēng)速計(jì)| 照度計(jì)| 噪音計(jì)| 輻照計(jì)| 聲級(jí)計(jì)| 溫濕度計(jì)| 紅外線測(cè)溫儀| 溫濕度儀| 紅外線溫度計(jì)| 露點(diǎn)儀| 亮度計(jì)| 溫度記錄儀| 溫濕度記錄儀| 光功率計(jì)| 粒子計(jì)數(shù)器| 粉塵計(jì)|
3 結(jié)論

　　3.1 色氨酸 λ_MAX在335～350nm范圍時(shí)，IMAX與再制干酪的融化性成強(qiáng)相關(guān)性（R²=0.9425）。用熒光分光光度計(jì)法測(cè)定涂抹型再制干酪的融合性是可行的。
　　3.2 I_MAX與再制干酪的融化性成負(fù)相關(guān)。