DNA測序的操作步驟

DNA測序的操作步驟

DNA（為英文Deoxyribonucleic acid的縮寫）,又稱脫氧核糖核酸，是染色體的主要化學(xué)成分，同時也是基因組成的，有時被稱為“遺傳微�！薄�DNA是一種分子，可組成遺傳指令，以引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機能運作。主要功能是長期性的資訊儲存，可比喻為“藍圖”或“食譜”。其中包含的指令，是建構(gòu)細胞內(nèi)其他的化合物，如蛋白質(zhì)與RNA所需。帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因，其他的DNA序列，有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用，有些則參與調(diào)控遺傳訊息的表現(xiàn)。

DNA測序
1．PCR測序反應(yīng)
　　(1) 取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
　　(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
2．醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
　　(1) 將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。
　　(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。
　　(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。
　　(1) 加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
　　(2) 將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。
　　(3) 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2min)，冰中驟冷，待上機。
4．上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，1.2kV預(yù)電泳5min，按編程次序自動進樣，再預(yù)電泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下電泳2h。電泳結(jié)束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結(jié)束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。
5．儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。
6．測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。