PCR檢測(cè)的質(zhì)量控制

PCR檢測(cè)的質(zhì)量控制

隨著獸醫(yī)防疫工作重要性的逐步提高，PCR檢測(cè)技術(shù)已被獸醫(yī)工作者比較廣泛認(rèn)可，已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室研究走進(jìn)了臨床應(yīng)用階段。如何提高PCR檢測(cè)質(zhì)量，已成為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員不可回避的一個(gè)問(wèn)題，它直接影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的可信度和獸醫(yī)防疫工作質(zhì)量。
       我們認(rèn)為，PCR檢測(cè)質(zhì)量的控制是一個(gè)系統(tǒng)工程，總體上涉及三個(gè)方面：一是試驗(yàn)儀器；二是試驗(yàn)試劑與耗材；三是人員操作。任何一個(gè)方面出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)影響PCR檢測(cè)質(zhì)量。

一、試驗(yàn)儀器

       PCR儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)（紫外分析儀或手提紫外等）以及移液器都可能影響PCR檢測(cè)的質(zhì)量。PCR儀是控制PCR反應(yīng)溫度變化的，其溫度和控制時(shí)間的準(zhǔn)確程度可能會(huì)影性PCR檢測(cè)質(zhì)量。移液器取液的準(zhǔn)確程度影響反應(yīng)體系是否能達(dá)到最佳反應(yīng)環(huán)境。紫外分析系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)敏感性有明顯的影響。紫外分析系統(tǒng)有3種類(lèi)型儀器：紫外分析儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、手提紫外燈。紫外分析儀直接用眼睛觀(guān)察瓊脂糖凝膠上DNA擴(kuò)增帶。紫外凝膠成像系統(tǒng)是在計(jì)算機(jī)上通過(guò)攝像系統(tǒng)對(duì)瓊脂糖凝膠上DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行觀(guān)察。手提紫外燈可以在電泳過(guò)程中直接對(duì)瓊脂糖凝膠上DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行觀(guān)察，使用方便，分辨率比較低。依據(jù)這些儀器的分辨率由高到低順序是紫外分析儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、手提紫外燈。紫外分析儀有時(shí)能看到弱陽(yáng)性擴(kuò)增帶，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上卻看不到。手提紫外燈只有在陽(yáng)性擴(kuò)增帶比較亮?xí)r才能看到，建議為保證檢測(cè)質(zhì)量最好不用手提紫外燈，可用于臨時(shí)的電泳結(jié)果觀(guān)察。
       儀器的質(zhì)量控制應(yīng)該通過(guò)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量認(rèn)證來(lái)實(shí)施，定期進(jìn)行儀器的效驗(yàn)。沒(méi)有質(zhì)量認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室可以定期請(qǐng)儀器生產(chǎn)廠(chǎng)家進(jìn)行效驗(yàn)和保養(yǎng)，確保所有儀器處于正常的工作狀態(tài)。

二、試驗(yàn)試劑與耗材

       在PCR檢測(cè)質(zhì)量控制中，試劑的選擇具有十分重要的作用，也是實(shí)驗(yàn)人員最為關(guān)注的檢測(cè)質(zhì)量控制因素。試劑一定選擇質(zhì)量和信譽(yù)好的廠(chǎng)商，一但選定后最好不要輕易改換。如果必須改換時(shí)應(yīng)與原產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格比對(duì)試驗(yàn)，包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗(yàn)。并且經(jīng)常要注意不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異。比如說(shuō)TaqDNA聚合酶，不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的質(zhì)量是有差異的，盡管都是標(biāo)出相同活性單位，但其標(biāo)定方法和保存液的成分以及運(yùn)輸過(guò)程的不同常常導(dǎo)致實(shí)際活性單位是有差異的，有時(shí)由于其活性低，使得弱陽(yáng)性樣品漏檢；有時(shí)由于其活性過(guò)高出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。這與ELISA檢測(cè)中酶結(jié)合物的作用相似。其實(shí)影響PCR檢測(cè)結(jié)果的試劑很多，可以這樣說(shuō)，PCR檢測(cè)用的所有試劑都可能影響檢測(cè)效果�？刂圃噭┑馁|(zhì)量是作好PCR檢測(cè)前提。我們認(rèn)為：最好是選擇PCR試劑盒來(lái)控制試劑質(zhì)量。
       評(píng)價(jià)一種PCR試劑盒，除了考慮它的敏感性、特異性、穩(wěn)定性、操作簡(jiǎn)便程度外，還應(yīng)包括：試劑盒提供的試劑覆蓋整個(gè)PCR檢測(cè)試驗(yàn)的程度。如果試劑盒提供了整個(gè)PCR檢測(cè)試驗(yàn)的試劑，表明該試劑盒對(duì)PCR檢測(cè)試驗(yàn)的試劑具有了全程控制性能。相反，PCR檢測(cè)的試劑的質(zhì)量控制程度比較低，意味著檢測(cè)質(zhì)量可控程度低。例如：溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用，如果在陽(yáng)光下長(zhǎng)時(shí)間的照射下失效了，在紫外燈下發(fā)熒光效能降低，可能會(huì)造成一些弱陽(yáng)性樣品的漏檢，出現(xiàn)假陰性。其它試劑出現(xiàn)問(wèn)題也是一樣影響檢測(cè)質(zhì)量。試劑盒在生產(chǎn)過(guò)程中，有一套試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制體系。每一試劑組分都經(jīng)過(guò)靈敏度、敏感性、特異性質(zhì)量控制的檢測(cè)，在有效期內(nèi)能確保每種試劑的質(zhì)量。因此，選擇試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)是比較理想的控制方法。在PCR檢測(cè)中，最好全部使用試劑盒提供試劑，對(duì)PCR檢測(cè)質(zhì)量控制有益。
       實(shí)驗(yàn)耗材也是影響PCR檢測(cè)質(zhì)量的因素之一。PCR反應(yīng)管薄厚以及傳導(dǎo)熱量性能等直接影響PCR檢測(cè)效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油，但有些PCR反應(yīng)管蓋子不嚴(yán)密，導(dǎo)致擴(kuò)增過(guò)程中反應(yīng)液水份蒸發(fā)，嚴(yán)重影響檢測(cè)靈敏度。PCR反應(yīng)體系是微量的，移液器的Tip頭生產(chǎn)質(zhì)量不好時(shí)，有時(shí)致使液體殘留量多或洪吸作用強(qiáng)，導(dǎo)致試劑盒中試劑量不夠，配置PCR反應(yīng)體系不準(zhǔn)，造成檢測(cè)質(zhì)量下降。
       在每次PCR檢測(cè)時(shí)，一定設(shè)立陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品。陰性對(duì)照樣品檢測(cè)為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過(guò)程的試劑沒(méi)有受到污染；陽(yáng)性對(duì)照樣品檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)，表明DNA提�。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，才能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行判定。因此，每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)立表明DNA提�。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定對(duì)照，只有設(shè)立試驗(yàn)全程的對(duì)照，才能證明試驗(yàn)結(jié)果成立。這一點(diǎn)對(duì)PCR和RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)是非常重要的。
       陽(yáng)性對(duì)照在試劑盒中是必須有的組分。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照有3種類(lèi)型：第一種是用檢測(cè)的病原微生物作為陽(yáng)性對(duì)照。這樣的直接對(duì)照優(yōu)點(diǎn)是直觀(guān)、準(zhǔn)確、本次試驗(yàn)完整條件對(duì)照，可以說(shuō)明此次試驗(yàn)是否成立。缺點(diǎn)是對(duì)檢測(cè)過(guò)程中增加了PCR污染的指數(shù)。另外，不能表明每個(gè)檢測(cè)樣品對(duì)照成立。第二種是設(shè)立一種與檢測(cè)病毒無(wú)關(guān)微生物作為陽(yáng)性對(duì)照。風(fēng)速計(jì)| 照度計(jì)| 噪音計(jì)| 輻照計(jì)| 聲級(jí)計(jì)| 溫濕度計(jì)| 紅外線(xiàn)測(cè)溫儀| 溫濕度儀| 紅外線(xiàn)溫度計(jì)| 露點(diǎn)儀| 亮度計(jì)| 溫度記錄儀優(yōu)點(diǎn)是降低了PCR污染的危險(xiǎn)性，并且提高了試劑盒的生物安全性。缺點(diǎn)是僅是參考陽(yáng)性對(duì)照，不夠直接、完全反映本次試驗(yàn)成立，也不能表明每個(gè)檢測(cè)樣品對(duì)照成立�？蛇m合怕污染的實(shí)驗(yàn)室或要求生物安全等級(jí)高的病原微生物的檢測(cè)。第三種是在每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)設(shè)立參考對(duì)照，除了陽(yáng)性擴(kuò)增帶之外，又設(shè)立一條擴(kuò)增帶，指示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)檢測(cè)情況。檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)出現(xiàn)兩條不同大小擴(kuò)增帶，陰性時(shí)出現(xiàn)一條擴(kuò)增帶。這種對(duì)照設(shè)立技術(shù)要求高，成本也高些，對(duì)照效果是最理想的，可以排除每個(gè)檢測(cè)樣品操作失誤或試劑出現(xiàn)問(wèn)題對(duì)檢測(cè)造成的影響。由于在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)對(duì)兩條模板同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，相互之間多少有一定的干擾，因此，對(duì)病原微生物檢測(cè)靈敏度或多或少有一定影響。此種對(duì)照方式可能會(huì)成為PCR對(duì)照的發(fā)展趨勢(shì)。

三、人員操作

       我們多名實(shí)驗(yàn)室人員曾經(jīng)對(duì)相同樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果確實(shí)存在差異。經(jīng)常檢測(cè)人員比其他實(shí)驗(yàn)人員檢測(cè)的靈敏度高10~100倍。說(shuō)明PCR檢測(cè)的試驗(yàn)確實(shí)有一定的操作技術(shù)需要熟悉和訓(xùn)練，不同的人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定的影響。加強(qiáng)人員的操作技能的訓(xùn)練是必須的，需要實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員對(duì)PCR檢測(cè)有一個(gè)熟練的過(guò)程。 
        PCR污染控制是PCR檢測(cè)操作人員必須非常注意一項(xiàng)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)室設(shè)置上分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴(yán)禁倒流。人員操作也應(yīng)非常注意，比如注意經(jīng)常打掃衛(wèi)生消毒、對(duì)移液器要定期進(jìn)行清洗、消毒。及時(shí)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等。