人類(lèi)遺傳分析中的新技術(shù)

人類(lèi)遺傳分析中的新技術(shù)

 人類(lèi)遺傳學(xué)的發(fā)展得益于過(guò)去十年中脫氧核糖核酸(DNA)分析技術(shù)的巨大進(jìn)步。由于數(shù)據(jù)采集速率的大大加快，人們針對(duì)龐大的數(shù)據(jù)量發(fā)展了半自動(dòng)化的方法用于原始數(shù)據(jù)采集、基因型分析和DNA直接測(cè)序。本文將介紹幾種與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析相關(guān)的最新進(jìn)展，這些方法在家族遺傳性致病基因的發(fā)現(xiàn)方面有著重要的應(yīng)用前景。

1 方法概述

1.1 微衛(wèi)星基因分型

        微衛(wèi)星標(biāo)記，又叫短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs），由連續(xù)的單一序列重復(fù)單元（如CACACA...或者GATAGATAGATA...）構(gòu)成[1]。人類(lèi)基因組包含成千上萬(wàn)的該種核苷酸二倍、三倍和四倍重復(fù)序列[2]。圍繞單一序列設(shè)計(jì)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物可以準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增特異性微衛(wèi)星序列。許多這樣的位點(diǎn)都具有多態(tài)性，用于分隔具有眾多重復(fù)長(zhǎng)度的等位基因。這些PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以用作對(duì)應(yīng)染色體片段的遺傳標(biāo)記，使之能夠按照家族進(jìn)行分類(lèi)。微衛(wèi)星的長(zhǎng)度通常在幾個(gè)減數(shù)分裂期內(nèi)保持不變，從而可以作為某些家族性疾病連鎖分析的有效工具[3]。

        目前微衛(wèi)星的使用還面臨著一些技術(shù)難題[4]。反復(fù)使用的PCR酶易于使合成的產(chǎn)物不保真，導(dǎo)致產(chǎn)生一系列比全長(zhǎng)略小的序列，通常這些序列與原序列僅相差一個(gè)重復(fù)單位[5]。除此之外，更為嚴(yán)重的是這些酶可能在產(chǎn)物3′端添加一個(gè)額外的非模板核苷酸。如果額外增加的核苷酸發(fā)生了突變就會(huì)導(dǎo)致峰分裂現(xiàn)象的出現(xiàn)，從而產(chǎn)生沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的雙核苷酸標(biāo)記物（dinucleotide markers）。減少變異的一種方法是在一條PCR擴(kuò)增引物5′端添加一個(gè)獨(dú)特的序列標(biāo)簽。進(jìn)行熒光基因分析時(shí)，這些帶有標(biāo)簽的引物會(huì)作為非標(biāo)記引物來(lái)使用（經(jīng)常但不總是作為反向引物）。盡管這種序列標(biāo)簽的具體反應(yīng)機(jī)理未明，但仍有幾個(gè)標(biāo)簽已見(jiàn)報(bào)道[6,7]。

        作者已經(jīng)用特異添加腺苷酸的PCR和普通的標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種序列標(biāo)簽的有效性。如圖1a和b所示，兩種不同雙核苷酸標(biāo)記物的差異在于：當(dāng)使用默認(rèn)設(shè)計(jì)的引物時(shí)，其對(duì)所用PCR試劑盒的敏感性不同�？墒牵�如果在未標(biāo)記引物中加入5′標(biāo)簽則可以減少兩種標(biāo)記物的變異，從而減少每一種標(biāo)記物出現(xiàn)問(wèn)題的幾率。這提示我們：作為一種常規(guī)的防范手段，應(yīng)當(dāng)在所有常規(guī)的微衛(wèi)星標(biāo)記中加入這種標(biāo)簽。

1.2 SNP 基因分型

        單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和微衛(wèi)星一樣可用于遺傳圖譜的繪制。由于基因經(jīng)常連鎖在一起遺傳，而連鎖的基因并非完全隨機(jī)地組成單體型，因此SNPs的內(nèi)在信息量比微衛(wèi)星攜帶的信息量要少些。然而協(xié)同分析的眾多SNPs所攜帶的信息則類(lèi)似或多于微衛(wèi)星。作為人類(lèi)基因組單體型圖 (HapMap)計(jì)劃的一部分，對(duì)幾百萬(wàn)個(gè)SNPs進(jìn)行了基因分型，并提供了幾種不同人種的等位基因頻率[8]。目前，用于SNP的高密度高通量芯片已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，可用于傳統(tǒng)家族性單基因紊亂的基因缺陷的遺傳圖譜繪制。

        為了比較高通量SNP芯片和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)家族性遺傳圖譜的有效性，作者利用大量不帶D型隱性尼曼-皮克病的新斯科舍阿卡迪亞家族成員驗(yàn)證一個(gè)已知的遺傳連鎖[9,10]。通過(guò)原位克隆鑒定得知潛在的致病基因是NPC1（OMIM#257220）[11]，從而在新斯科舍家族患病個(gè)體中證實(shí)了NCPI存在著純合子突變[12]。作者又利用Xba 50K芯片（Affymetrix公司，圣克拉拉，加拿大）對(duì)兩位患病的遠(yuǎn)房親屬和一位該家族未患病親屬進(jìn)行基因分型（見(jiàn)圖2）。如表1所示，兩位患者 18號(hào)染色體上相同的等位基因中，具有共享純合性的SNPs的最大拉伸長(zhǎng)度約為7.7M堿基對(duì)，其中包括圍繞NPC1的位于19.4M堿基對(duì)處的71個(gè)連續(xù)的SNPs。未患病親屬樣本2244中有30個(gè)標(biāo)記與患病者不一致，某些是雜合子而另一些是其他SNP等位基因的純合子（該數(shù)據(jù)未顯示）。由此可見(jiàn) SNP芯片可以省時(shí)、省力、省錢(qián)地成功復(fù)制整個(gè)家族樣品的連鎖圖譜。

        由于跨復(fù)合染色體的連續(xù)SNPs在絕對(duì)長(zhǎng)度和數(shù)量上存在微小差異，所以作者用Xba和Hind芯片測(cè)定全部116 000個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的分布。間隙長(zhǎng)度的分配呈雙模態(tài)分布，約在400和22 000堿基對(duì)處出現(xiàn)兩個(gè)峰。除著絲粒外，2~3M堿基對(duì)長(zhǎng)度之間存在3個(gè)間隙， 而1~2M堿基對(duì)長(zhǎng)度之間還存在33個(gè)間隙。有些間隙處于末端著絲粒處，有些則位于基因相對(duì)稀少的區(qū)域，而其他的間隙可能由于信息SNPs附近缺少合適的抑制位點(diǎn)而處于基因密集區(qū)。 1~3M堿基對(duì)范圍內(nèi)的間隙數(shù)量提示我們應(yīng)當(dāng)充分注意對(duì)高密度連鎖不平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋。目前，最新出現(xiàn)的超高通量500K SNP板正變得越來(lái)越有用，對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而言，與一般的芯片相比其具有更大的優(yōu)越性。

1.3 突變檢測(cè)

        基因發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的最終步驟是突變檢測(cè)。盡管像變性高效液相色譜（dHPLC）等間接物理化學(xué)檢測(cè)方法可以用于突變檢測(cè)，但是DNA測(cè)序仍然是序列變異（也就是突變）檢測(cè)的最權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn)。手工檢查大量序列信息不僅效率低下，而且由于人為誤差容易遺失突變信息。幾種半自動(dòng)化方法已經(jīng)被發(fā)展用于滿足分子遺傳分析逐漸增長(zhǎng)的需要 [13-17]。

        作者對(duì)用于序列變異檢測(cè)的突變檢測(cè)軟件（MutSurv，SoftGenetics公司，州立學(xué)院，巴拿馬）進(jìn)行了評(píng)估。利用幾個(gè)含有已知單堿基改變、插入和缺失變異的樣本驗(yàn)證了該軟件的有效性。該軟件對(duì)樣品標(biāo)記進(jìn)行排列和比較以提供參考或得到內(nèi)在的一致序列標(biāo)記和執(zhí)行檢測(cè)運(yùn)算法則，并通過(guò)質(zhì)量得分、不同色譜圖和繪圖輸出等方式報(bào)告潛在突變／多態(tài)性。如果向其提供包括外顯子和內(nèi)含子位點(diǎn)在內(nèi)的開(kāi)放閱讀框和已知變異，則可利用該軟件輸出和得到染色體組信息。

        利用MutSurv軟件對(duì)被測(cè)樣品中所有已被鑒定的變異進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果在圖3a和b中給出。在單核苷酸變異的情況下，軟件能標(biāo)出突變并方便地闡述該突變對(duì)潛在基因編碼蛋白可能的影響。MutSurv軟件在幾種情況下都能鑒定出dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)注的已知SNPs。通過(guò)對(duì)軟件中沿外顯子繪制的平面圖與UCSC（加利福尼亞大學(xué)，Santa Cruz公司）基因組瀏覽器界面進(jìn)行比較，可以非常容易地鑒定出已知的SNPs。在有插入和缺失的情況下，該軟件不僅能夠自動(dòng)檢測(cè)幾個(gè)不同的突變，而且能對(duì)結(jié)果進(jìn)行去卷積，從而準(zhǔn)確地描述出插入和缺失的確切序列（見(jiàn)圖3c），得到的結(jié)果可通過(guò)手工檢查進(jìn)行最終驗(yàn)證。

        MutSurv軟件標(biāo)出了有問(wèn)題的序列特別是閱讀框末端附近這些序列中的幾個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果。軟件的新版本允許對(duì)末端進(jìn)行剪切，從而減少假陽(yáng)性的發(fā)生。盡管某些擴(kuò)增子在正反兩相上獲得的序列可能存在問(wèn)題，不過(guò)正反兩種方向進(jìn)行的突變檢測(cè)仍然可以縮小低質(zhì)量序列中假陽(yáng)性的影響范圍。

1.4 新的遺傳計(jì)劃

        作者最近致力于從事總體范圍內(nèi)的基因探索，努力查明并從分子水平描述加拿大東部省份許多單基因人類(lèi)紊亂病的特征（見(jiàn)圖4）。這些工作采用本文描述的技術(shù)極大地提高了工作效率。將來(lái)可能也需要對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行一些改進(jìn)，包括制備更高通量的SNP芯片；降低SNP芯片和 DNA測(cè)序的成本；以及減少個(gè)別先證者（指不依賴(lài)于家庭中其他成員而被獨(dú)立檢出的病例）整個(gè)基因組或整個(gè)外顯子測(cè)序所需的最終成本。

2 方法應(yīng)用

2.1 樣品采集

        利用標(biāo)準(zhǔn)方法從全血或者唾液中提取DNA。歷史上除了抽血取樣外還有口腔取樣和采用血液污跡的方法，不過(guò)后兩種方法很不穩(wěn)定而且 DNA產(chǎn)量低下。利用The Oragene saliva kit (DNA Genotek公司，渥太華，安大略湖，加拿大)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。收集6個(gè)不同個(gè)體的樣品，基因組DNA的產(chǎn)量為每人20~320μg不等（2 mL唾液樣品）。通過(guò)凝膠電泳可知未消化的多是高分子質(zhì)量的DNA。可能由于糖或脂質(zhì)成分的殘留導(dǎo)致某些樣品存在輕度渾濁，A260/A280值為1.4~1.6（經(jīng)A320校對(duì)）。通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行微小改進(jìn)，包括用70%酒精沖洗，就可以提高 A260/A280值。這樣只需10 ng樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)就可以很好地用于微衛(wèi)星基因分型和DNA測(cè)序。盡管作者沒(méi)有對(duì)全基因組擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用進(jìn)行系統(tǒng)地評(píng)估，但應(yīng)注意，已有廠家用Qiagen（巴倫西亞，加拿大）試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行重新純化后用Affymetrix高密度SNP芯片證明了該方法的有效性。

        所使用的全部樣品均未違反相關(guān)的倫理制度，并征得了患者本人的同意。

2.2 微衛(wèi)星基因分型

        微衛(wèi)星標(biāo)記所需的引物可從GDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。常規(guī)熒光微衛(wèi)星標(biāo)記由原始基因組序列使用Tandem Repeat Finder [18]（與UCSC基因組瀏覽器結(jié)合[19,20]）、Repeat Masker[21,22]和Primer 3[23]軟件發(fā)展而來(lái)。每個(gè)得到的擴(kuò)增子都帶有一個(gè)標(biāo)記熒光的正向引物和成對(duì)的未標(biāo)記反向引物，該反向引物5′末端帶或不帶5′-GTTTCTT-3′ 序列標(biāo)簽都可以。對(duì)兩種不同的PCR循環(huán)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。普通的標(biāo)準(zhǔn)條件為：95 ℃（3 min）（循環(huán)1次）；95 ℃（1 min），55~60 ℃（1 min），72℃（1 min）（循環(huán)30次）；72 ℃（2 min）（循環(huán)1次）。特異添加腺苷酸的PCR反應(yīng)條件為：95 ℃（5 min）（循環(huán)1次）；94 ℃（15 s），55℃（15 s），72 ℃（30 s）（循環(huán)10次）；89 ℃（15 s），55 ℃（15 s），72 ℃（30 s）（循環(huán)20次）；72 ℃（30 min）（循環(huán)1次）[7]。擴(kuò)增后用ABI 377在6%聚丙烯酰胺上進(jìn)行電泳分析；再用ABI GenScan軟件得到相應(yīng)譜圖（ABI 377和Gen-Scan購(gòu)自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特市，加拿大）。然后通過(guò)GeneMarker軟件（SoftGenetics公司）對(duì)基因型譜圖進(jìn)行分析。基因型名稱(chēng)以文本形式輸出并用PedCheck軟件[24]進(jìn)行遺傳驗(yàn)證。

2.3 SNP基因分型

        加拿大多倫多大學(xué)兒童醫(yī)院的微陣列研究室通過(guò)Xba 50K SNP芯片對(duì)基因型進(jìn)行收集。利用Affymetrix軟件得到基因型的名稱(chēng)并以電子表格的形式從研究室輸出。有58 960 個(gè)SNPs被收集，其中58 494個(gè)在人基因組中的位點(diǎn)是唯一的。純合子SNP等位基因的長(zhǎng)度可以通過(guò)對(duì)不同國(guó)家的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行直接查詢(xún)而得到，并對(duì)其物理位置或連鎖純合的狀態(tài)一致性 (identical by state, IBS) 標(biāo)記數(shù)量進(jìn)行儲(chǔ)存。結(jié)果中每個(gè)染色體著絲粒間隔的缺失序列和標(biāo)記信息已被人工刪除。

轉(zhuǎn)速計(jì)| 水份計(jì)| 分析儀| 溶氧計(jì)| 電導(dǎo)度計(jì)| PH計(jì)| 酸堿計(jì)| 糖度計(jì)| 鹽度計(jì)| 酸堿度計(jì)| 電導(dǎo)計(jì)| 水分測(cè)定儀| 濁度計(jì)| 色度計(jì)| 粘度計(jì)| 滴定儀| 密度計(jì)| 熱流計(jì)| 濃度計(jì)|  

2.4 突變檢測(cè)

        熒光DNA測(cè)序的掃描文件通過(guò)在ABI 377上進(jìn)行電泳而獲得。將該文件輸入到Mutation Suveyor軟件中以對(duì)序列變異進(jìn)行分析。廠家的數(shù)據(jù)庫(kù)地址或者國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）可以提供基因組外顯子/內(nèi)含子和蛋白質(zhì)編碼信息。合成的野生型參照序列（wild-type reference sequence）掃描文件也可通過(guò)該軟件由相同的基因組序列產(chǎn)生。